AmpliQ 5x HOT EvaGreen? HRM Mix (ROX), (5x) stężony
Gotowy Mastermix zawierający polimerazę typu hot-start i barwnik fluorescencyjny EvaGreen? do analiz Real-time PCR HRM (zawiera barwnik referencyjny ROX)
AmpliQ 5x HOT EvaGreen? HRM Mix (ROX) jest gotową do użycia mieszaniną do prowadzenia analizy qPCR i HRM. Mastermix zawiera wszystkie niezbędne komponenty reakcji, czyli: polimerazę hot-start, mieszaninę ultra czystych dNTPs [10 pmol/?l], MgCl2 oraz wiążący się do dsDNA barwnik EvaGreen?, umożliwiający analizę produktów PCR metodą HRM oraz barwnik referencyjny ROX. Aby przygotować reakcję, należy do Mastermixu dodać wodę, startery oraz matrycę DNA.
Polimeraza hot-start jest aktywowana przez 15-minutową inkubację w 95 °C. Ta właściwość uniemożliwia wydłużanie starterów, które hybrydyzują do matrycy w miejscach niespecyficznych oraz zapobiega powstawaniu dimerów starterów w niskiej temperaturze podczas reakcji qPCR.
EvaGreen? jest barwnikiem fluorescencyjnym nowej generacji, który wiąże się ilościowo do dwuniciowego DNA. W przypadku braku dsDNA fluorescencja pozostaje na bardzo niskim poziomie (1-4 % false positive). Zakres widma barwnika EvaGreen? jest podobny do barwnika SYBR? Green, jednakże wykazuje on kilka cech czyniących go idealnym do analiz HRM, tj: wysoka stabilność, nie inhibuje reakcji PCR oraz udowodniono, że nie jest mutagenny ani cytotoksyczny. EvaGreen? jest kompatybilny z większością dostępnych platform do analizy Real-time PCR, po ustawieniu tych samych parametrów, jak dla SYBR? Green lub FAM. EvaGreen? jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy BIOTUM, INC.
ROX jest wewnętrznym pasywnym barwnikiem referencyjnym, który umożliw a normalizację sygnału fluorescencyjnego reportera, generowanego w reakcji qPCR.
HRM (ang. High Resolution Melting) jest nowoczesną techniką umożliwiającą wykrywanie zmian genetycznych (m.in. SNP, mutacje, metylacje) w amplikonie PCR. Znacznie przewyższa i wykracza poza klasyczną analizę krzywych topnienia w Real-time PCR, pozwalając śledzić denaturację dwuniciowego DNA bardzo szczegółowo i uzyskać większą ilość informacji na temat przebiegu tego procesu, niż za pomocą jakiejkolwiek wcześniejszej techniki. Produkty reakcji można klasyfikować w zależności od ich sekwencji, długości, zawartości zasad GC lub komplementarności nici. Technika umożliwia nawet analizę zmian pojedynczych nukleotydów, takich jak SNP (ang. single nucleotide polymorphism). Mutacje w produktach PCR wykrywa się w oparciu o zmianę w kształcie krzywej topnienia produktu PCR.
Skład mieszaniny AmpliQ 5x HOT EvaGreen? HRM Mix (ROX)
- Polimeraza DNA hot-start
- Bufor reakcyjny 5x EvaGreen? HRM
- MgCl2 12.5 mM
- Mix dNTPs 10 pmol/?l
- Barwnik EvaGreen?
- BSA
- Barwnik referencyjny ROX
Dostępność:
dostępny w objętości 1mL (250rxn) i 4mL (1000rxn)
Przechowywanie:
- długotrwałe -20 °C, po rozmrożeniu +4 °C
- Chronić przed światłem
- Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania