FireTaq Polimeraza DNA
FireTaq Polimeraza DNA jest chemicznie zmodyfikowaną wersją polimerazy Taq pozwalającą na prowadzenie reakcji amplifikacji DNA typu ?hot-start? i jest aktywowana dopiero po 15 min inkubacji w temp. 95 °C. Użycie FireTaq Polimerazy DNA w znacznym stopniu podnosi specyficzność reakcji. Enzym pozwala zmniejszyć ilość niespecyficznie powstających produktów i w rezultacie otrzymać właściwy produkt często tam, gdzie w warunkach zwyczajnej reakcji amplifikacji nie jest to możliwe. Źródłem pochodzenia FireTaq Polimerazy DNA jest szczep bakteryjny Thermus aquaticus.
Zastosowanie FireTaq Polimerazy DNA daje doskonałe wyniki w amplifikacji nawet niewielkiej ilości DNA. Jej niezaprzeczalną zaletą jest efektywna i wysoce specyficzna amplifikacja trudnego materiału, jakim jest modyfikowany dwusiarczkiem DNA.
FireTaq Polimeraza DNA prowadzi syntezę DNA w kierunku 5 '- -> 3? w obecności jonów Mg2+ oraz przy odpowiednim stężeniu dNTPs.
FireTaq Polimeraza DNA wykazuje również aktywność egzonukleazy 5 - -> 3?, która ujawnia się wyłącznie podczas pracy enzymu na dsDNA. Aktywność 5' - -> 3? egzonukleazy umożliwia wykorzystanie go w reakcji amplifikacji DNA metodą Real-time PCR.
Otrzymany produkt reakcji może zawierać na końcach dodatkową zasadę (A). Jest to szczególnie przydatne podczas późniejszej reakcji klonowania, natomiast w przypadku konieczności otrzymywania produktów bez dodatkowej zasady (A), polecamy polimerazy DNA izolowane z archeabakterii ? PrestoPfu lub HiFiTaq Polimerazę DNA.
Maksymalna długość produktu jaką można otrzymać z wykorzystaniem FireTaq Polimerazy DNA wynosi w przybliżeniu 5000 ? 6000 pz.
Ważna informacja
W celu przeprowadzenia pełnej aktywacji FireTaq Polimerazy DNA w reakcji PCR konieczne jest wydłużenie wstępnej denaturacji enzymu w temp. 95 °C do 12-15 min (tzw. gorący start - hot start).
Produkt PCR, amplifikowany z udziałem polimerazy FireTaq ,wymaga dodatkowego oczyszczenia przed sekwencjonowaniem.
Bufor reakcyjny B1 bez Mg2+ i detergentu (10x): 0.8 M Tris-HCl, 0.2 M (NH4)2SO4
Bufor reakcyjny B2 bez Mg2+ (10x): 0.8 M Tris-HCl, 0.2 M (NH4)2SO4, 0.2% v/w Tween 20
Bufor do przechowywania (10x): 50% v/v glicerol, 20 mM Tris-HCl (pH 8.7 / 25°C), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, związki stabilizujące
Definicja jednostki: Jedną jednostkę enzymu definiuje się jako ilość enzymu, niezbędną do przeprowadzenia reakcji inkorporacji 10 nmoli dezoksyrybonukleotydów dNTPs do frakcji polinukleotydowej zabsorbowanej na nośniku stałym, w czasie 30 min w temperaturze 74 °C.
Stężenie: 5 U/?l
Zestaw zawiera:
- FireTaq Polimerazę DNA
- Bufor reakcyjny B1 i B2
- MgCl2 25 mM
- S mix 10x (dodatkowy składnik ułatwiający amplifikację trudnych matryc DNA np. bogatych w pary G-C; składnik ten powinien być podany do reakcji w stężeniu końcowym 1x, 2x lub 3x; Mix S nie jest buforem reakcyjnym powinien być dodawany wyłącznie gdy spodziewane są niespecyficzne oddziaływania w reakcji PCR)
Przechowywanie: - 20 °C Przewóz w specjalnych warunkach nie jest niezbędny.